Значение цветных реакций состоит в том, что они дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях, растворах и установить аминокислотный состав различных природных белков. Эти реакции применяются как для качественного, так и для количественного определения белка и содержащихся в нем аминокислот. Некоторые реакции присущи не только белкам, но и другим веществам, например, фенол, подобно тирозину, дает розово-красное окрашивание с реактивом Миллона, поэтому проведения одной какой-либо реакции для установления наличия белка не достаточно.

Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные – биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все а -аминокислоты и белки); 2) специфические – только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот, например реакция Фоля (на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу), реакция Миллона (на тирозин), реакция Сакагучи (на аргинин) и др.

При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:

Цветные реакции на белки (качественные реакции)

Цветные реакции на белки Опыт 1. Биуретовая реакция.

Биуретовая реакция – качественная на все без исключения белки , а также продукты их неполного гидролиза , которые содержат не менее двух пептидных связей .

Принцип метода. Биуретовая реакция обусловлена присутствием в белках пептидных связей (- СО – NH -), которые в щелочной среде образуют с сульфатом меди (ІІ) окрашенные в красно-фиолетовый цвет медные солеобразные комплексы . Биуретовую реакцию дают также некоторые небелковые вещества, например биурет (NH 2 -CO-NH-CO-NH 2), оксамид (NH 2 CO-CO-NH 2), ряд аминокислот (гистидин , серин , треонин , аспарагин ).

Биуретовая реакция с глицином

Порядок выполнения работы.

К 1 мл исследуемого 1% раствора белка добавляют равный объем 10 % раствора гидроксида натрия (NaOH) щелочи и затем 2-3 капли 1 % раствора сульфата меди (CuSO 4). разбавленного, почти бесцветного раствора медного купороса.

При положительной реакции появляется фиолетовая окраска с красным либо синим оттенком.

Опыт 2. Реакция на «слабосвязанную серу».

Принцип метода. Это реакция на цистеин и цистин. При щелочном гидролизе «слабосвязанная сера» в цистеине и цистине достаточно легко отщепляется, в результате чего образуется сероводород, который, реагируя со щелочью, дает сульфиды натрия или калия. При добавлении ацетата свинца(II) образуется осадок сульфида свинца(II) серо-черного цвета.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 1 мл неразбавленного куриного белка, прибавляют 2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия. Смесь осторожно кипятят (чтобы смесь не выбросило).

При этом выделяется аммиак, который обнаруживается по посинению влажной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипении, а затем добавляют 0,5 мл раствора ацетата свинца(II). Наблюдается выпадение серо-черного осадка сульфида свинца(II):

Химизм реакции:

В пробирку наливают 1 мл. неразбавленного куриного белка добавляют 2 мл. концентрированного раствора щелочи, кладут несколько кипятильников. К горячему раствору добавляют раствор плюмбита натрия – образуется желто-бурое или черное окрашивание. (Плюмбит натрия готовят следующим образом: к 1 мл уксуснокислого свинца добавляют раствор щелочи по каплям до растворения образующего вначале осадка гидроксида свинца).

При наличии в молекуле белка серосодержащих аминокислот (цистина, цистеина) из этих аминокислот постепенно отщепляется сера в виде иона в степени окисления – 2, наличие которого и обнаруживается ионом свинца, образующим с ионом серы черный нерастворимый сульфид свинца:

Pb(CH 3 COO) 2 + 2NaOH Pb(OH) 2 + 2 CH 3 COONa,

Pb(OH) 2 + 2NaOH Na 2 PbO 2 + H 2 O,

Na 2 S + Na 2 PbO 2 + 2H 2 O PbS + 4NaOH.

Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция белков.

Принцип метода. Эта реакция используется для обнаружения a-аминокислот, содержащих ароматические радикалы. Тирозин, триптофан, фенилаланин при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образуют нитропроизводные, имеющие желтую окраску. В щелочной среде нитропроизводные этих a-аминокислот дают соли, окрашенные в оранжевый цвет. Желатин, например, не содержащий ароматических аминокислот, не дает ксантопротеиновой пробы.

Порядок выполнения работы.

К 1 мл 10 %-го раствора белка куриного яйца добавляют 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. В результате коагуляции белка в содержимом пробирки образуется белый осадок или помутнение. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется в результате гидролиза. После охлаждения добавляют 1–2 мл 20%-го раствора гидроксида натрия (до появления оранжевой окраски раствора).

Рассмотрим механизм ксантопротеиновой реакции по радикалу тирозина:

Химизм реакции :

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 4. Реакция Адамкевича (на присутствие в белках триптофана).

Принцип метода. Белки, содержащие триптофан, в присутствии глиоксиловой и серной кислот дают красно-фиолетовое окрашивание. Реакция основана на способности триптофана взаимодействовать в кислой среде с альдегидами глиоксиловой кислоты (являющейся примесью к концентрированной уксусной кислоте) с образованием окрашенных продуктов конденсации. Реакция протекает по уравнению:

Желатин не дает этой реакции, т.к. он не содержит триптофана. Окраска возникает за счет реакции триптофана с глиоксиловой кислотой, всегда присутствующей в уксусной кислоте в виде примеси.

Эту же реакцию на триптофан можно провести, используя вместо уксусной кислоты формальдегид 2,5%-ный раствор концентрированной H 2 SO 4. Раствор перемешать и через 2-3 мин. добавить при взбалтывании 10 капель 5%-ного нитрита натрия. Развивается интенсивно-фиолетовое окрашивание, на этом основан принцип метода реакции.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают несколько капель неразбавленного белка и прибавляют 2 мл. ледяной уксусной кислоты и несколько капель глиоксиловой кислоты. Смесь слегка нагревают до растворения образующегося осадка, охлаждают и, сильно наклонив пробирку, осторожно по стенке приливают концентрированную H 2 SO 4 так, чтобы обе жидкости не смешивались.

Через 5-10 минут на границе раздела двух слоев наблюдают образование красно-фиолетового кольца.

Опыт 5. Нингидриновая реакция.

Принцип метода. a-Аминокислоты реагируют с нингидрином, образуя сине-фиолетовый комплекс (пурпур Руэманна), интенсивность окраски которого пропорциональна количеству аминокислоты. Реакция идет по схеме:

Химизм реакции :

Реакция с нингидрином используется для визуального обнаружения a-аминокислот на хроматограммах (на бумаге, в тонком слое), а также для колориметрического определения концентрации аминокислот по интенсивности окраски продукта реакции.

Продукт этой реакции содержит в своем составе радикал (R) исходной аминокислоты, который обусловливает различную окраску: голубую, красную, и т.д. соединений, возникающих при реакции аминокислот с нингидрином.

В настоящее время нингидриновая реакция широко используется как для открытия отдельных аминокислот, так и для определения их количества.

Порядок выполнения работы.

В пробирку наливают 1 мл 1-10%-го разбавленного раствора белка куриного яйца и 1-2 мл 1%-го раствора нингидрина в ацетоне. Содержимое пробирки перемешивают и в течение 2-3 мин осторожно нагревают на водяной бане до появления сине-фиолетового окрашивания, свидетельствующее о присутствии в белке α -аминокислот.

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Опыт 6. Реакция Сакагучи.

Принцип метода. Эта реакция на аминокислоту аргинин основана на взаимодействии аргинина с a-нафтолом в присутствии окислителя. Ее механизм еще полностью не выяснен. По-видимому, реакция осуществляется по следующему уравнению:

Поскольку производные хинониминов (в данном случае нафтохинона), у которых водород иминогруппы –NH– замещен на алкильный или арильный радикал, всегда окрашены в желто-красные тона, то, по-видимому, оранжево-красный цвет раствора при проведении реакции Сакагучи объясняется возникновением именно производного нафтохинонимина. Не исключена, однако, вероятность образования еще более сложного соединения за счет дальнейшего окисления оставшихся NH-групп аргининового остатка и бензольного ядра a-нафтола:

Порядок выполнения работы.

К 2 мл. 1%-го разбавленного раствора белка куриного яйца добавляют 2 мл. 10%-го гидроксида натрия (NaOH) и несколько капель 0,2%-ного спиртового раствора α -нафтола. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Затем приливают 0,5 мл. гипобромита натрия (NaBrO) или гипохлорита натрия (натрий хлорноватистокислый – NaOCl), перемешивают. Тотчас появляется красное, постепенно усиливающееся окрашивание.

Немедленно добавляют 1 мл 40%-го раствора мочевины для стабилизации, быстро развивающегося оранжево-красного окрашивания.

Эта реакция характерна для соединений, содержащих остаток гуанидина

NH = C –NH 2 ,

и указывает на присутствие в белковой молекуле аминокислоты-аргинина:

NH = C –NH – (CH 2) 3 –CH –COOH

Оформление опыта: сделать вывод и написать уравнение реакции.

Лабораторная работа 15 «Белки»

Аминокислотами называются азотсодержащие органические соединения, в молекулах которых содержатся аминогруппы и карбоксильные группы.

В зависимости от взаимного расположения карбоксильной и аминогрупп различают -, в-, г- и т.д. аминокислоты. Например,

Чаще всего термин "аминокислота" применяют для обозначения карбоновых кислот, аминогруппа которых находится в - положении, т.е. для - аминокислот. Общую формулу - аминокислот можно представить следующим образом:

В зависимости от природы радикала (R) - аминокислоты делятся на алифатические, ароматические и гетероциклические.

Аминокислоты вступают друг с другом в реакцию поликонденсации, приводя к амидам кислот. Продукты такой конденсации называются пептидами. При взаимодействии двух аминокислот образуется дипептид:

Образующаяся группировка -СО-NH - называется пептидной связью.

При взаимодействии дипептида с новой молекулой аминокислоты получается трипептид и т.д.

Примеры простейших аминокислот

Белки - это азотсодержащие высокомолекулярные органические вещества со сложным составом и строением молекул. Представляют собой природные полимеры (сложные полипептиды), молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединённых между собою амидной (пептидной) связью.

Это природные полипептиды с высокими значениями молекулярной массы (от 5-10 тыс. до 1 млн. и более). Они входят в состав клеток и тканей всех живых организмов и являются основной составной частью нашей пищи.

В состав белков входит углерод, водород, кислород и азот. В значительно меньшем количестве в их состав могут входить также сера, фосфор и другие элементы. Белки представляют собой весьма нестойкие соединения, что затрудняет изучение их физических и химических свойств. Конечными продуктами распада белков являются

б- аминокислоты. Молекулярная масса их очень велика.

С белками связаны все жизненные процессы. Они служат питательными веществами, регулируют обмен веществ, исполняя роль ферментов - катализаторов обмена веществ, способствуют переносу кислорода по всему организму и его поглощению, играют важную роль в функционировании нервной системы, являются механической основой мышечного сокращения, участвуют в передаче генетической информации и т.д.

Опыт 1. Свёртывание белка при нагревании.

Свёртывание белков, т.е. денатурация - процесс утраты белком природной (нативной) конформации, сопровождающаяся обычно потерей его биологической функции. При денатурации под влиянием внешних факторов (температуры, механического воздействия, действия химических реагентов и ряда других факторов) происходит разрушение вторичной, третичной и четвертичной структур белковой макромолекулы. Первичная структура, а, следовательно, и химический состав белка не меняются. Изменяются физические свойства: снижается растворимость, способность к гидратации, теряется биологическая активность. Меняется форма белковой макромолекулы, происходит укрупнение.

Для работы служит белок куриного яйца, растворённый в воде (белок одного яйца на 150 мл воды).

Описание опыта . Небольшое количество раствора белка нагреть на горелке до кипения. Наблюдается помутнение жидкости. Полученный осадок не растворяется ни при охлаждении, ни при разбавлении водой, т.е. реакция является необратимой.

Опыт 2. Ксантопротеиновая реакция

Ксантопротеиновая реакция указывает на наличие в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан). При действии концентрированной азотной кислоты происходит реакция нитрования ароматических ядер с образованием окрашенных в жёлтый цвет нитросоединений. При действии аммиака нитросоединения изомеризуются с образованием интенсивно окрашенных солеобразных продуктов.

Описание опыта . К 1 мл раствора белка добавить 5-6 капель концентрированной НNО3 до появления белого осадка (или мути от свернувшегося под влиянием кислоты белка). При нагревании раствор и осадок окрасятся в ярко-желтый цвет (осадок почти полностью гидролизуется и растворится).

Смесь охладить, добавить (осторожно, не взбалтывая) по каплям избыток концентрированного водного аммиака (или едкой щелочи) до щелочной реакции. Выпадающий сначала осадок кислотного альбумината растворится, жидкость окрасится в ярко-оранжевый цвет.

Биуретовая реакция указывает на наличие в белке повторяющихся пептидных группировок -СО-NН-. Это подтверждается тем, что белки дают фиолетовое окрашивание при действии небольшого количества раствора медного купороса в присутствии щёлочи. Окраска объясняется образованием комплексных соединений меди.

Опыт 3. Биуретовая реакция

Описание опыта . В пробирку помещают 1 мл раствора яичного белка, 1 мл раствора гидроксида натрия и 1-2 капли раствора сульфата меди (II). Жидкость окрасится в красно-фиолетовый цвет (при малом содержании белка к его раствору в щёлочи осторожно прибавить 0,5-1 мл раствора CuSO4, окраска появится на границе слоёв). Уравнение реакции:

CuSO4 + 2NaOH > Na2SO4 + Cu(OH)2v

2R - CH - COOH + Cu(OH)2 > (R- CH-COO)2Cu + 2H2O

Опыт 4. Осаждение белка солями тяжёлых металлов

Описание опыта . Берут две пробирки и помещают в них по 1 мл раствора яичного белка и медленно, при встряхивании, по каплям, добавить в одну пробирку насыщенный раствор сульфата меди (II), в другую - 20%-ный раствор ацетата свинца. Образуются осадки трудно растворимых солеобразных соединений белка. Опыт иллюстрирует применение белка как противоядие при отравлении солями тяжёлых металлов. Уравнения реакций:

• 2R - CH - COOH + CuSO4 > (R- CH-COO)2Cu + H2SO4
• 2R-CH-COOH + (CH3COO)2Pb> (R-CH-COO)2Pb + CH3COOН

Опыт 4. Открытие серы в белках

Описание опыта . В пробирку наливают около 0,5 мл раствора ацетата свинца и прибавляют раствор гидроксида калия до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца. В другую пробирку наливают около 2-3 мл раствора белка и приливают такой же объём полученного раствора плюмбита. Нагревают смесь до кипения в течение 2-3 минут. Появление тёмного окрашивания указывает на образование сульфита свинца. Напишите уравнения реакций.

1) Биуретовая реакция (на все белки)

Белок + СuSO 4 + NaOH яркое фиолетовое окрашивание

СuSO 4 + 2NaOH Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4

голубой осадок

С = О: Cu: O = C C = O: N

N H OH N: O = C

растворимый комплекс

ярко фиолетового цвета

2) Ксантопротеиновая реакция (для белков, имеющих в составе АК с ароматическим радикалом)

белок + HNO 3 (k) осадок жёлтого цвета

| || -- H 2 O | ||

N CH C─ + HONO 2 N CH C─

жёлтого цвета

Если добавить концентрированный раствор аммиака, то появляется оранжевое окрашивание, так как в нитробензоле происходит смещение электронной плотности.

3) Цистеиновая реакция - реакция на остаток АК, содержащий S

Белок + NaOH + Pb(CH 3 COO) 2 PbS + белок

Чёрный цвет

| Pb + PbS

БИОКАТАЛИЗ

Одной из важных черт химических реакций, протекающих в живых организмах, является их каталитическая природа. Живую клетку можно представить как миниатюрный каталитический реактор. Отличие клетки от колбы химика заключается в том, что если в колбе все реакции протекают независимо (осуществляется фундаментальный принцип независимости реакций), то в клетке все происходит взаимосвязано.

Это происходит не потому, что нарушаются физические законы или клетка подчиняется другим законам – нет, в живых материях действуют одни законы. Просто в процессе эволюции природой был создан эффективный аппарат регулирования всех клеточных реакций, который позволяет всей клетке контролировать соотношение продуктов таким образом, чтобы оптимально функционировали все реакции.

Таким образом, все биохимические реакции – это реакции каталитические.

Биологические катализаторы называются ферментами или энзимами .

В принципе, в клетке протекают те же химические реакции, что и в химической лаборатории, но на условия протекания реакций в клетке накладываются жёсткие ограничения, а именно T = 37 ◦ С и P = 1 атм.

Поэтому часто процессы, которые в лаборатории протекают в 1 стадию, в живых клетках в осуществляются в несколько стадий.

Сущность каталитических реакций, несмотря на многообразие, сводится к тому, что исходные вещества, образуют с катализатором промежуточное соединение , которое относительно быстро превращается в продукты реакции, регенерируя катализатор.

Иногда промежуточные соединения можно выделить в чистом виде, но обычно они состоят из неустойчивых молекул, обнаружение которых возможно только с помощью очень чувствительных спектральных приборов.

Процесс с участием катализатора – циклический или круговой.

Мера активности фермента – число оборотов (число молей субстрата, претерпевающих изменение за 1 минуту в расчёте на 1 моль фермента)

Число оборотов может достигать 10 8 .

Довольно часто циклы работы нескольких катализаторов соединяются вместе, образуя круговой процесс.

Вещества S1 и S2 превращаются в продукты Р1 и Р2. В ходе этого превращения сначала S1 реагирует с третьим веществом Х и катализатором Е1, образуя промежуточный продукт М1, который в свою очередь при помощи катализатора Е2 превращается в промежуточный продукт М2 и т. д.

Ускоряющее действие катализатора связано с уменьшением энергии активации (это та дополнительная энергия, которая должна быть сообщена одному молю вещества, чтобы частицы вещества стали реакционно способными и могли преодолеть энергетический барьер реакции).

К основным свойствам ферментов относятся:

Эффективность, которая заключается в степени ускорения (ускорение в 100 млн раз).

Повышенная субстратная специфичность. Ферменты отличают субстрат благодаря биологическому узнаванию (комплементарности).

Повышенная специфичность катализируемой реакции. Большинство ферментов ускоряет один тип реакций.

Повышенная специфичность по отношению к оптическим изомерам (могут узнавать левые и правые изомеры).

Причина всех уникальных свойств ферментов - их пространственное строение. Обычно это глобулярные белки, намного превосходящие по размерам субстрат. Это обстоятельство приводит к тому, что в процессе эволюции на поверхности фермента образовался активный центр, который комплементарен субстрату. Это замок и ключ.

Условно активные центры делятся на: связывающие и каталитические.

Связывающий центр связывает субстрат и оптимально ориентирует его по отношению к катализируемой группе, в катализирующем же центре сосредоточены все активные группы.

Если для проведения реакции необходимо провести гидролиз (белков, липидов), то катализируемый центр формируется боковыми радикалами АК – остатков.

В этом случае фермент состоит только из полипептидных цепей. Однако кроме гидролитических реакций протекают и другие: окислительно-восстановительные, реакции переноса каких-либо групп.

В этих случаях в ферментах содержится небелковая часть. Эта часть – кофермент (rофактор, простетическая группа). Белковая часть обеспечивает связывающее действие, а кофермент – каталитическое. Белковая часть – апофермент.

Апофермент + кофермент ↔холофермент

1. В соответствии с веществами, которые необходимо идентифицировать, нужно указать известные качественные реакции, реагенты и идентификационные признаки.

В нашем случае можно использовать следующие реакции:

2. Предложить в виде схемы наиболее эффективную последовательность определения указанных соединений.

3. Указать методику проведения реакций, условия и написать уравнение реакции с указанием характерного идентификационного признака.

В качестве предварительной пробы на растворимые белки можно использовать реагенты, вызывающие денатурацию (сворачивание): тепловую или химическую.

При решении данной задачи возможны варианты анализа.

Вариант 1. Последовательность идентификации содержимого склянок может быть следующей:

1. Проводим предварительное испытание на присутствие белков. Пробы каждой из 4-х склянок нагреваем в пламени спиртовки. В пробирках с растворами белков наблюдается денатурация (белок свертывается и теряет растворимость). В пробирках с пробами других веществ изменений не наблюдается.

2. Идентифицируем белки, используя их различие в аминокислотном составе. Проводим ксантопротеиновую реакцию с пробами белков. В пробирке с раствором яичного белка наблюдается растворение первоначально образующегося желтого осадка и появление оранжевого окрашивания, так как в состав яичного белка входят ароматические кислоты (тир, фен, три). Желатин не содержит ароматических аминокислот, проба на их наличие будет отрицательной.

3. Идентифицируем содержимое склянок с глюкозой и аминокислотой, используя реакцию с нингидрином. В пробирке с глицином появляется характерное фиолетовое окрашивание.

4. Подтверждаем наличие глюкозы в оставшейся склянке. Глюкоза относится к восстанавливающим моносахаридам, поэтому для ее идентификации можно использовать либо реакцию «серебряного зеркала» (при нагревании на водяной бане появляется характерный зеркальный налет серебра на стенках пробирки), либо реакцию «медного зеркала» (при нагревании в пламени спиртовки появляется характерный осадок оксида меди (I) кирпично-красного цвета).

Вариант 2.

1. Определяем принадлежность соединения к группе белков, используя биуретовую реакцию со свежеосажденным гидроксидом меди (II). В пробирках с пробами растворов белков появляется характерное фиолетовое кольцо. В пробирке с глюкозой так же наблюдается растворение голубого осадка гидроксида меди (II) и появление василькового окрашивания за счет образования комплексного соединения – сахарата меди, в пробирке с аминокислотой появляется темно-синее окрашивание вследствие образования комплексного соединения – глицината меди.

2. Подтверждаем наличие глюкозы. Обе пробирки нагреваем в пламени спиртовки. В пробирке с глюкозой образуется характерный осадок оксида меди (II) кирпично-красного цвета, так как глюкоза относится к группе восстанавливающих моносахаридов.

3. Идентифицируем белки, используя их различие в аминокислотном составе. С новыми пробами растворов белков проводим ксантопротеиновую реакцию (см. вар. 1).

Для более точной идентификации аминокислоты можно взять новую пробу и проделать реакцию с раствором нингидрина.

Не исключены и другие варианты, отличающиеся последовательностью реакций и реагентами.